ПОДЕЛИТЬСЯ | ПЕЧАТЬ | ЭЛ. АДРЕС
Начну с напоминания, которое часто упускается из виду в публичных дискуссиях: МРНК-вакцины против COVID-19 — это действительно новые медицинские препараты.
До получения экстренных разрешений в 2020 году технология мРНК-вакцин никогда не применялась в больших масштабах на людях. Только два клинических исследования, одно от Pfizer-BioNTech и другое от Moderna, когда-либо проверяли эту платформу на людях. В общей сложности, примерно 37 000 человек когда-либо получали мРНК-вакцину за всю историю медицины (не считая более раннего опыта с вакцинами против бешенства, ЦМВ и рака, ограниченного гораздо меньшими по масштабу исследованиями на ранних стадиях). Это не критика; это просто констатация факта. Но это означает, что долгосрочный профиль безопасности этих продуктов был и остается недостаточно изученным.
Далее следует информация, знакомая почти всем молекулярным биологам. Она сложна, но я стараюсь упростить её, учитывая важность вопроса. Крайне важно чётко изложить молекулярную структуру для всех, потому что способ производства этих вакцин напрямую определяет содержимое флакона.. А содержимое флакона после инъекции распространится по всему организму и запустит каскад событий, которые могут привести к долгосрочным последствиям для здоровья.
Транскрипция in vitro — это не просто производственный этап.
Модифицированные мРНК-вакцины производятся с использованием процесса, называемого транскрипцией in vitro (IVT).)IVT — это метод, используемый для синтеза модифицированной мРНК, которая в конечном итоге становится активным ингредиентом вакцины.
Это не пустяковое техническое обстоятельство. Метод IVT коренным образом определяет молекулярный состав конечного продукта.
Ученые компании BioNTech, в том числе те, кто непосредственно участвовал в разработке вакцины Pfizer, опубликовали подробный обзор.1 В описании говорится о том, как реакции IVT генерируют не только целевую полноразмерную мРНК, но и ряд побочных продуктов и примесей, как они обычно удаляются и каковы могут быть их биологические последствия, если они сохраняются. Эти производственные процессы, а также образующиеся побочные продукты, были подробно описаны компанией Moderna в ее патентах (US10,653,712 B2 и US10,077,439 B2). Но что еще важнее, эта молекулярная биология была хорошо изучена задолго до COVID-19. Все это не является предположением.
Исходный материал: ДНК-матрицы
По своей сути, реакция IVT начинается с двухцепочечной ДНК, кодирующей желаемый белок. В данном случае, это спайковый белок SARS-CoV-2.
В мРНК-вакцинах используется последовательность, кодирующая спайковый белок: генетически модифицированных для повышения стабильности и клеточной толерантности, включая две аминокислотные замены, которые отличают его от вирусного шипа. Эта модификация заключается в следующем: умышленный.
Сама ДНК-матрица может принимать различные формы. На ранних этапах клинических испытаний компании Pfizer использовались фрагменты ДНК, полученные методом ПЦР. Однако в коммерческом производстве использовалась ДНК, полученная из плазмид. Это важно, поскольку плазмиды содержат дополнительные регуляторные последовательности. В случае Pfizer к ним относятся такие элементы, как промотор SV40 и последовательности ori, что вызывает опасения в случае их попадания в клетки человека.
После добавления этой ДНК-матрицы в реакцию IVT, вместе с РНК-полимеразой и другими компонентами, она транскрибируется в мРНК (рис. 1).
Компания IVT производит побочные продукты по своей конструкции.Хотя желаемым результатом IVT является полноразмерный продукт мРНК, фактический результат более сложен. Он включает в себя различные побочные продукты в виде (1) различных видов РНК, включая двухцепочечную РНК (дцРНК), (2) ДНК, присоединенной к РНК (гибриды РНК-ДНК), и (3) свободной ДНК от исходной матрицы (рис. 2).
Образование этих побочных продуктов хорошо задокументировано и неизбежно, поэтому последующая очистка абсолютно необходима для обеспечения безопасности.
Рисунок 2. Побочные продукты и примеси при производстве IVT. Изображение адаптировано из 1.Очистка имеет известные ограничения.
После производства необходимы два этапа очистки: сначала удаляется ДНК, а затем — побочные продукты РНК (рис. 3):
Рисунок 3. Удаление побочных продуктов IVT. Изображение адаптировано из 2.Для удаления ДНК в реакционную смесь добавляют фермент, называемый ДНКазой I, который обычно используется для деградации загрязняющей ДНК. Хотя ДНКаза I эффективна против свободной матричной ДНК, многочисленные исследования, в том числе работы самих ученых BioNTech, показывают, что ДНКаза I неэффективна для удаления ДНК, прикрепленной к РНК (гибриды РНК-ДНК).
Это ограничение не вызывает споров. Оно задокументировано в литературе.
Что показали независимые анализы
Этот контекст имеет решающее значение для интерпретации результатов недавних независимых анализов готовых флаконов с вакциной.
Исследователи3 и регуляторы4 Сообщается об обнаружении примесей ДНК практически во всех протестированных пробирках. Эти примеси включали как двухцепочечную ДНК, так и РНК-ДНК-гибриды, которые оказались устойчивыми к обработке ДНКазой I.
В некоторых образцах ДНК, кодирующая спайковый белок, присутствовала в количествах, более чем в 100 раз превышающих уровни других плазмидных последовательностей.5Это указывает на неравномерное или неполное расщепление. Секвенирование и количественный ПЦР-анализ дополнительно выявили фрагменты ДНК средней длиной около 200 пар оснований, некоторые из которых превышали 4 килобазы. В нескольких случаях наблюдались последовательности, охватывающие почти всю плазмиду.
В совокупности эти результаты поднимают серьезные вопросы о стабильности и полноте очистки в процессе крупномасштабного производства, а также о потенциальных биологических последствиях остаточных нуклеиновых кислот для человека.
Почему загрязняющие вещества нуклеиновых кислот имеют биологическое значение
РНК и ДНК являются мощными активаторами врожденных иммунных путей. Это не предположение. Рецепторы распознавания образов и путь cGAS-STING активно реагируют на чужеродные нуклеиновые кислоты, вызывая воспаление, замедление роста и даже гибель клеток.
Именно по этим механизмам препараты для генной терапии подлежат строгому контролю безопасности.
Как ни парадоксально, мРНК-вакцины против COVID-19 были разработаны с модификациями, специально предназначенными для снижения этой мощной активации врожденного иммунитета. Но гибриды РНК-ДНК и фрагменты ДНК все равно будут вызывать сильный иммунный ответ, несмотря на эти модификации.
Настойчивость порождает новые вопросы.
В настоящее время имеются веские доказательства того, что мРНК и белок спайкового белка сохраняются в тканях человека в течение недель, месяцев и даже лет после вакцинации (таблица 1).
Мы пока не знаем, отражает ли эта персистенция длительную стабильность мРНК, непрерывную трансляцию или механизмы, основанные на ДНК. Но, учитывая вероятность интеграции ДНК и долгоживущую неинтегрированную плазмидную ДНК в мышечных клетках,6 Вполне разумно предположить, что сохранение мРНК, белка и антител к белку Spike спустя годы после вакцинации неразрывно связано с примесями ДНК и побочными продуктами после внутривенной вакцинации.
Таблица 1. Сохранение мРНК и белка Spike после вакцинации у людей.Краткосрочные и долгосрочные последствия для безопасности
В совокупности эти данные поднимают ряд важных вопросов, касающихся безопасности.
Во-первых, сразу после вакцинации были зарегистрированы острые иммунные реакции, включая цитокиновый шторм и анафилаксию. Такие сильные воспалительные реакции не следует сразу же списывать на связь с примесями, особенно учитывая то, что известно об активации иммунной системы, вызванной нуклеиновыми кислотами.
Во-вторых, и это более важно, существуют долгосрочные риски. Постоянная экспрессия белка Spike может способствовать развитию хронических иммунных синдромов. Еще большее беспокойство вызывает возможность интеграции ДНК, которая несет в себе риски инсерционной мутагенеза или нарушения генов. Это означает риск развития рака или дефектов развития в зависимости от того, где и в каком возрасте произошла интеграция ДНК.
Примечательно, что само Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) в своих информационных материалах заявляет, что эти вакцины не были протестированы. Была проведена оценка на канцерогенность (образование раковых клеток) или генотоксичность (повреждение ДНК), что является рутинной и ожидаемой процедурой при надзоре за генной терапией, где долгосрочный мониторинг является стандартом.
Пробелы в регулировании использования ДНК в мРНК-вакцинах
Поскольку факт наличия остаточной ДНК в мРНК-вакцинах больше не вызывает сомнений, вопрос заключается в том, соответствуют ли действующие рекомендации и пределы безопасности требованиям к мРНК-вакцинам. Нас заверили, что количество побочных продуктов ДНК находится в пределах, установленных нормативными требованиями. Так каковы же рекомендации FDA относительно побочных продуктов и загрязняющих веществ ДНК?
Наиболее часто цитируемое руководство FDA по остаточной ДНК (≤10 нг на дозу) было разработано для вирусных вакцин, производимых в живых клетках, которые фрагментированы и «не содержат ДНК», обладая ограниченной способностью проникать в клетки человека. Однако мРНК-вакцины не производятся в клетках, их остаточная ДНК не является ДНК клеток-хозяев, и, что наиболее важно, ДНК в мРНК-вакцинах не является «не содержащей ДНК». Она связана с системами доставки на основе липосомальных наночастиц (ЛНП), которые специально облегчают проникновение ДНК внутрь клеток. В руководстве FDA от 2010 года четко указано, что оно не устанавливает соответствующий порог безопасности для ДНК, связанной с продуктами на основе ЛНП.
Другое часто цитируемое руководство ВОЗ касается рекомбинантных белковых терапевтических препаратов и остаточной ДНК в таких продуктах, как моноклональные антитела или гормоны, производимые в генно-модифицированных клетках. Здесь также остаточная ДНК происходит из клеток-хозяев или экспрессионных плазмид, присутствует в виде следовых количеств неинкапсулированной ДНК (в чистом виде), а конечным продуктом является очищенный белок, а не терапия на основе нуклеиновых кислот (мРНК-вакцина). Поэтому данное руководство не применяется к мРНК-вакцинам.
Ни стандарты FDA, ни стандарты ВОЗ, наиболее часто упоминаемые в отношении остаточной ДНК, не были разработаны для мРНК-вакцин и не решают напрямую проблему безопасности.
Что ВОЗ заявила о мРНК-вакцинах после их внедрения.
В 2022 году Всемирная организация здравоохранения выпустила рекомендации, специально посвященные мРНК-вакцинам.7Примечательно, что этот документ был опубликован. после Глобальное внедрение этих продуктов. В нем конкретно указано, что данное руководство было разработано в ответ на: «вопросы безопасности, производства и регулирования, связанные с этой новой технологией.В документе также содержится несколько важных утверждений:
Поскольку подробная информация об используемых методах производства пока недоступна, контрольные меры для безопасных и эффективных мРНК-вакцин еще не стандартизированы, а некоторые детали остаются конфиденциальными и, следовательно, недоступны для общественности, разработка конкретных международных руководств или рекомендаций в настоящее время не представляется возможной.
Далее в нем говорится: «Подробные процедуры производства и контроля… должны быть обсуждены с Национальным регулирующим органом (NRA) и утверждены им.] В каждом конкретном случае рассматривается индивидуально.
ВОЗ признает, что контроль за мРНК-вакцинами еще не стандартизирован и что разработка конкретных международных руководящих принципов или рекомендаций не представляется возможной. Кроме того, для оценки каждого случая национальными органами необходим регулирующий надзор.
Об этом было заявлено после начала применения мРНК-вакцин..
На момент написания этой статьи Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) до сих пор не разработало стандартизированные рекомендации для мРНК-вакцин и не предоставило никаких доказательств и данных, подтверждающих безопасность, в поддержку каких-либо ограничений на использование ДНК в мРНК-вакцинах.
В заключение стоит повторить: хотя технология мРНК не нова, до COVID-19 она регулировалась как генная терапия, а не как традиционная вакцина. Проблемы безопасности, связанные с побочными продуктами ДНК в вакцинах против COVID-19, будут такими же и для любых мРНК-вакцин, включая вакцины против гриппа, респираторно-синцитиального вируса или даже мРНК-вакцины против рака.
Это объясняется тем, что мРНК-продукты принципиально отличаются. Они должны проникать в клетки и давать им команду на производство чужеродного белка. Это отличается от любых других традиционных вакцин, которые доставляют белок напрямую. Для этой платформы нет клинических прецедентов, как и для многократного введения. И уж точно нет прецедентов в масштабах населения.
На данном этапе, когда пандемии нет, накапливаются данные о механизмах действия и клинические наблюдения, а также на рынок выходит множество мРНК-вакцин, нам необходима прозрачность и прямое взаимодействие с регулирующими органами, в частности с FDA, в отношении проведения серьезных исследований безопасности, направленных на разработку критически важных руководящих принципов для производства этих продуктов, особенно в части, касающейся побочных продуктов ДНК.
Новые технологии требуют тщательного анализа, а не молчания, манипуляций или цензуры.
Референсы
1 https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2024.1426129/full
2 Webb C, Ip S, et al Mol Pharm. 2022 Apr 4;19(4):1047-1058. doi: 10.1021/
3 https://www.tandfonline.com/doi/10.1080/08916934.2025.2551517?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
4 https://www.tga.gov.au/resources/publication/tga-laboratory-testing-reports/summary-report-residual-dna-and-endotoxin-covid-19-mrna-vaccines-conducted-tga-laboratories.
5 https://zenodo.org/records/17832183; https://www.scstatehouse.gov/CommitteeInfo/SenateMedicalAffairsCommittee/PandemicPreparedness/Phillip-Buckhaults-SC-Senate-09122023-final.pdf
6 Ван и др. (2004) – «Обнаружение интеграции плазмидной ДНК в геномную ДНК хозяина после внутримышечной инъекции и электропорации» (Генная терапия, 2004). Мышам внутримышечно вводили немодифицированную плазмидную ДНК, после чего проводили электропорацию для усиления поглощения. Используя высокочувствительную ПЦР на очищенной геномной ДНК (с гель-электрофорезом для удаления внехромосомных форм), авторы выявили четыре независимых события интеграции через 4 недели после инъекции. Секвенирование соединений подтвердило случайные места интеграции (отсутствие предпочтительных горячих точек), что согласуется с негомологичным соединением концов. Частота интеграции была низкой, но измеримой. Это одна из наиболее наглядных демонстраций фактических спонтанных событий интеграции немодифицированной плазмидной ДНК in vivo в мышцах. Следует отметить, что в этом исследовании использовалась усиленная доставка ДНК посредством электропорации, которую можно сравнить с усиленной доставкой с помощью ЛНП.
Мартин и др. (1999) – «Плазмидная ДНК-вакцина против малярии: потенциал геномной интеграции после внутримышечной инъекции» (Human Gene Therapy). В этом более раннем исследовании плазмидная ДНК тестировалась внутримышечно на мышах, а для выявления интеграции использовались гибридизация по Саузерну и ПЦР на высокомолекулярной геномной ДНК. Хотя персистенция в основном носила внехромосомный характер, авторы сообщили о наличии признаков редкой интеграции в некоторых образцах (хотя и не с такой точной секвенированной структурой, как в более поздних работах). Это установило критерий низкого риска, но признало потенциальную возможность очень редкого возникновения таких событий, что повлияло на последующие рекомендации FDA по ДНК-вакцинам.
Ледвит и др. (2000) – «Плазмидные ДНК-вакцины: исследование интеграции в клеточную ДНК хозяина после внутримышечной инъекции мышам» (Intervirology). Введение плазмидной ДНК без плазмидной основы внутримышечно мышам показало наличие интеграций, и хотя никакой заметной интеграции не наблюдалось, ДНК все еще обнаруживалась в четырехглавой мышце бедра до 26 недель. ДНК была внехромосомной.
7 74-й доклад Комитета экспертов ВОЗ по биологической стандартизации, Приложение 3. Оценка качества, безопасности и эффективности мРНК-вакцин для профилактики инфекционных заболеваний: нормативные аспекты. https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/vaccine-standardization/annex-3—mrna-vaccines_who_trs_1039_web-2.pdf
Доктор Шарлотта Купервассер — выдающийся профессор кафедры онтогенетической, молекулярной и химической биологии медицинского факультета Университета Тафтса и директор Лаборатории конвергенции Тафтса. Доктор Купервассер получила международное признание благодаря своим знаниям в области биологии молочной железы, рака молочной железы и его профилактики. Она является членом Консультативного комитета по вопросам иммунизации.
